11月14日，抗体药物实验室周末学术沙龙由魏欣博士主讲。魏博士详细介绍了猪繁殖与呼吸综合征病毒利用病毒凋亡模拟入侵宿主细胞的分子机制研究。
猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus，PRRSV）引起的一种高度接触性传染病。PRRS 在全球范围内广泛传播，对世界各国尤其是我国养猪产业造成了巨大的经济损失。多年来，PRRS 以及 PRRSV 一直是兽医学和病毒学领域的重点研究对象，但目前对于 PRRS 的防控并未取得实质性成效，究其原因是 PRRSV 具有独特而且复杂的感染机制。目前研究发现 PRRSV 是在宿主细胞表面必需受体蛋白CD163 以及其他辅助因子的参与下，通过低 pH 依赖的网格蛋白介导的内吞途径入侵宿主细胞的。深入研究 PRRSV 入侵机制，将有助于全面理解 PRRSV 致病机理，为新型抗病毒药物研发、新型疫苗研制提供理论依据。
作为一种新型的入侵方式，病毒凋亡模拟在病毒入侵中发挥着重要作用。本研究围绕 PRRSV利用病毒凋亡模拟入侵宿主细胞这一新机制，展开了一系列研究：
1. 发现了 PRRSV 囊膜表面暴露有磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PtdSer）。PtdSer 暴露在细胞表面，是细胞凋亡的一个显著特征，可以作为一种重要的吞噬信号。研究发现部分囊膜病毒在出芽包被囊膜时会获取宿主细胞 PtdSer 并暴露在自身囊膜外模拟细胞凋亡。本研究首先通过密度梯度离心（density gradient centrifugation）分别获得了纯化的 PRRSV-1 型和 PRRSV-2 型不同代表毒株。随后，利用 PtdSer 特异性结合蛋白 annexin V 和抗 PtdSer 单克隆抗体，分别通过流式细胞术（flow cytometry，FCM）和 Dot-blot 检测，证明了 PRRSV 病毒粒子表面存在 PtdSer。这一发现证实 PRRSV 具有进行病毒凋亡模拟的分子基础。
2. 鉴定出宿主细胞表面识别PRRSV 凋亡模拟的PtdSer 受体为TIM（T-cell immunoglobulin and mucin domain）家族蛋白。病毒表面暴露的 PtdSer 会被宿主细胞 PtdSer 受体识别，因此本研究通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹实验（IB）筛选出在 MARC-145 细胞和 PAMs 上表达的 PtdSer 受体分别为 TIM-1 和 TIM-4。随后发现敲低 TIM-1/4 的表达水平，抑制了 PRRSV RNA 的复制、N 蛋白的表达、PRRSV 子代病毒滴度以及PRRSV 的吸附和内化，表明 TIM 在PRRSV 入侵过程中发挥重要作用。通过 Dot-blot，pulldown 以及抗体封闭实验等，证明了 TIM 通过 PtdSer 直接与 PRRSV 结合。
3. 揭示 PRRSV 通过 TIM-1 诱导巨胞饮并且利用巨胞饮作为入侵途径。病毒能够通过凋亡模拟，诱导并利用宿主自身的内吞途径完成入侵。利用 dextran 作为巨胞饮的指示分子，在敲低 TIM-1 后观察并比较细胞接毒后不同时间点对 dextran 的摄取；通过鬼笔环肽标记 F-actin 观察膜凸起， 证明PRRSV 通过TIM-1 诱导宿主细胞产生巨胞饮。利用巨胞饮特异性抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)- 阿米洛利（EIPA）、肌动蛋白动员抑制剂细胞松弛素 D 和拉春库林 A 进行抑制，PRRSV 与 SNX5 共定位等实验，证明了巨胞饮是 PRRSV 入侵宿主细胞的另外一种途径。
4. 证明了PRRSV 利用巨胞饮入侵宿主细胞需要Rac1/Cdc42-Pak1 信号通路和CD163 的参与。巨胞饮需要 Rho GTPases 酶家族分子及其下游效应分子 Pak1 或 PI3K 等通过细胞信号转导触发。
